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合理补充丁酸的工程酵母菌助力IBD的细胞颐养
A tailored series of engineered yeasts for the cell-dependent treatment of inflammatory bowel disease by rational butyrate supplementation
Gut Microbes
PMID: 38381494 [IF: 12.2]
炎症性肠病 (IBD) 的颐养主要包括药物干涉、生存形势调整，严重者需要外科颐养，已毕弥远的临床缓解是IBD预后处置的遑急猜度打算。盘考标明，IBD患者与健康东谈主比较，肠谈的丁酸水平显耀裁减。丁酸是一种短链脂肪酸，具有抗炎特点，故意于规复肠上皮樊篱稳态、颐养免疫、保管肠谈微生态均衡，对IBD具有潜在的颐养收尾。靶向颐养肠谈中的丁酸含量，有望从细胞门路已毕IBD的精确颐养。
现在使用丁酸缓解结肠炎症的轨范包括口服丁酸盐、补充丁酸盐产生菌、丁酸盐微胶囊以及针对特定部位给药的靶向颐养，但均存在一定局限性。口服丁酸的生物利费用有限，大多量丁酸产生菌不行平直期骗膳食纤维，需要与其他细菌交叉给药，且安全性有待验证；而丁酸微胶囊和靶向期间的本钱较高。
酿酒酵母动作益生菌合成的自然居品，在食物和医药范围有着普通的应用。使用酿酒酵母合成丁酸可动作IBD的潜在颐养轨范。该盘考修复了一种新式的丁酸盐给药期间，更正酿酒酵母使其分娩丁酸盐。通过评价不同外源丁酸合成基因对酵母丁酸合成的孝顺，构建4个要道基因的异源抒发，修复出可合成丁酸的重组酿酒酵母菌株，同期在工程酵母菌株中加入了零散的代谢模块，加多丁酸的产量。在IBD患者和动物模子中评估后，盘考细目了一株BYJ16菌株，具备最好的丁酸合成才智和颐养收尾。
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图1. 颐养IBD的丁酸产生菌的构建经由。(a) IBD患者肠腔内丁酸含量低于浩荡东谈主。(b) 以酿酒酵母为基础，重构丁酸合成门路，通过颐养代谢模块，构建一系列具有不同丁酸分娩才智的工程酵母。(c) 丁酸盐工程酵母J16可使IBD患者肠谈内丁酸水平规复到浩荡水平；丁酸开释可颐养肠谈微生物组的动态均衡。(d) 丁酸盐工程酵母J16可使结肠炎小鼠肠谈中的丁酸规复到浩荡水平。
香蕉视频www.5.在线观看图源：参考文件 [1]
收尾
① 酿酒酵母丁酸生物合成门路的构建
丁酸的生物合成触及几个酶促反馈：乙酰乙酰-辅酶A通过3-羟丁基-辅酶A脱氢酶的作用改换为3-羟基丁酰辅酶A，随后在环氧乙酰-辅酶A水合酶的作用下改换为巴豆酰辅酶A。巴豆酰辅酶A经过还原生成丁酰辅酶A，终末改换为丁酸。盘考选拔了编码3-羟丁基-辅酶A脱氢酶和环氧乙酰-辅酶A水合酶的C. beijerinckii Hbd和Crt基因，用于更正酵母菌合成丁酸。
普氏杆菌是主要的丁酸产生菌，约占通盘粪便微生物的5%，是肠谈中最丰富的细菌。为使丁酰辅酶A和乙酰辅酶A移动酶异源抒发，催化丁酰辅酶A改换为丁酸，东谈主工合成了普氏杆菌中编码这两种酶的BCoAT基因，并对酵母密码子偏好进行了优化。进一步评估发现，酿酒酵母中的Hbd、Crt、Ter和BCoAT基因的抒发故意于丁酸盐的产生。盘考先将普氏杆菌的丁酸合成系统整合到酿酒酵母中，未能将乙酰乙酰-辅酶A改换为丁酸。随后，将基因的运转子调控元件拼装成抒发框，并整合到BY4741菌株的基因组构建了重组菌株BYJ01，其丁酸产量为420 mg/L。
② 相连代谢模块晋升丁酸酯产量
证据丁酸合成的代谢通路，盘考者在BYJ01菌株中同期过抒发与乙酰乙酰辅酶A代谢联系的ERG10和MCT1基因，得到重组菌株BYJ04，发现BYJ04菌株的丁酸产量高于BYJ01 (702 mg/L vs 420 mg/L)。乙酰辅酶A是合成乙酰乙酰辅酶A的要道前体，触及苹果酸合成酶的代谢门路可能导致乙酰辅酶A的损失，导致丁酸产量的减少。通过敲除编码苹果酸合成酶的MLS1基因构建菌株BYJ05，其丁酸产量加多到792 mg/L。为了进一步晋升乙酰辅酶A水平，敲除BYJ05菌株的CIT2基因得到重组菌株BYJ06，丁酸产量升高至943 mg/L。随后，在BYJ06中过抒发与乙酰辅酶A合成联系的ACS1和ACS2基因，或只抒发ACS1基因，构建菌株BYJ08和BYJ07，二者丁酸产量隔离升高至1.24 g/L和1.06 g/L。
既往盘考标明，酒精脱氢酶基因ADH1和ADH4的敲除不错灵验地晋升酿酒酵母2，3-丁二醇的产量。因此，盘考评估了菌株BYJ08敲除ADH4或同期敲除ADH1和ADH4对丁酸酯产量的影响，构建菌株BYJ12和BYJ13。BYJ12 (敲除ADH4) 的丁酸盐产量降至0.8 g/L，而ADH4和ADH1同期敲除的BYJ13丁酸产量加多至1.3 g/L。由于NADH在乙醛还原为酒精的过程中被损失，敲除ADH基因导致还原门路中断，可导致NADH开释，加多丁酸产量。为了开释更多NADH，盘考者同期敲除了BYJ08菌株的GPD1和GPD2基因，干扰甘油合成，色噜噜电影得到了双基因敲除菌株BYJ15，丁酸产量显耀晋升。进一步敲除BYJ08中的ADH1和ADH4，GPD1和GPD2，得到了重组菌株BYJ16，其丁酸酯产量达到1.45 g/L。
③ 工程酵母在复杂氧分压环境中的性能
鉴于肠谈中氧气散播的不样式性，盘考评估了工程酵母在不同氧分压下的进展。在测试菌株中，BYJ17在厌氧条款下丁酸产量最高，为2.47g/L，而在富氧条款下为1.84g/L。其他工程酵母菌如BYJ07、BYJ12和BYJ16，在厌氧条款下的丁酸产量也比富氧条款下加多。因此，工程酵母更合适在厌氧环境中分娩丁酸。盘考同期阐发，乙酰辅酶A增强模块增强了工程酵母厌氧条款下的丁酸合成，且工程酵母即使在在低氧条款下，也能保握最好的丁酸产量。
④ 工程酵母菌颐养IBD患者的肠谈微生物组
为评估丁酸工程酵母对结肠炎的疗效，盘考者汇注了6名轻中度溃疡性结肠炎患者的粪便样本评估肠谈微生物，6名健康志愿者动作对照。将样本在厌氧条款下培养，通过在工程酵母中添加不同的代谢模块 (J1到J17)，培养物中的丁酸含量随丁酸合成增强而加多，其中J17的丁酸产量最高。同期发现，IBD组肠谈微生物的种种性显耀减少，而期骗工程酵母干涉可逆转这一变化，标明工程酵母通过产生丁酸，可改善IBD患者肠谈微生物的构成。
丁酸工程酵母菌 (J8、J16和J17) 通过产生丁酸盐、加多乳酸杆菌和双歧杆菌等益生菌的相对品貌以及减少无益细菌的存在，颐养IBD患者肠谈微生物群的动态均衡。然则由于丁酸产量的不同，工程酵母的颐养收尾也不相同。其中，J16分泌适量的丁酸盐，对轻至中度UC患者的肠谈微生物组具有最显耀的改善收尾，即最大放手地加多益生菌的相对品貌，灵验颐养肠谈微生物组的动态均衡 (图2)。
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图2. 丁酸工程酵母菌颐养IBD患者肠谈微生物群的动态均衡。(a) 使用工程酵母在体外干涉IBD患者肠谈微生物区系的期间门路图。(b) 不同工程酵母对IBD患者肠谈微生物组干涉24小时后培养物中丁酸含量的变化。(c) 不雅察不同工程酵母菌处理后肠谈微生物组的物种丰富度。(d和e) 用CHO-1猜度量和α指数分析肠谈微生物群的种种性。(f) β-种种性分析。(g) 主坐标分析。
图源：参考文件 [1]
⑤ 工程酵母对TNBS指挥的IBD小鼠的颐养作用
盘考进一步评估了工程酵母在TNBS指挥的C57BL/6小鼠结肠炎中的颐养收尾。将小鼠分为6组：对照组、模子组 (TNBS)、BY组 (TNBS+BY)、J8组 (TNBS+J8)、J16组 (TNBS+J16) 和J17组 (TNBS+J17)。除对照组和模子组外，其余各组小鼠每天口服不同的工程酵母菌 (BY、J8、J16和J17) 直到第7天。测定小鼠结肠推行物中的丁酸水平，以评估工程酵母将丁酸分泌到肠谈中的才智。通过监测体重、疾病活动指数 (DAI)、结肠长度、结肠组织学评分和脾分量的变化，评估工程酵母的颐养收尾。
收尾线路，BY处理组小鼠的丁酸含量最低，J17颐养组肠谈中丁酸含量最高，且高于对照组，可能对小鼠结肠炎的颐养收尾不利。而通过J16补充丁酸盐，比J17丁酸盐产量略低，可使结肠炎小鼠的丁酸含量规复到浩荡水平，可动作结肠炎的最好颐养剂量。
与TNBS组比较，TNBS+J8、TNBS+J16和TNBS+J17组小鼠的体重加多，疾病活动指数(DAI) 裁减，结肠长度加多，脾分量减少，组织学严重进度得到改善，但急性结肠炎的严重进度并未较着改善 (图3)。此外，工程酵母显耀裁减了促炎细胞因子水平，加多抗炎细胞因子水平。J16进展出最显耀的抗炎作用，其炎症因子如IL-6的水平较低，而抗炎因子如IL-10的水平较高，而J17的抗炎作用不如J16显耀。
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图3. 工程酵母对TNBS指挥的小鼠结肠炎模子的颐养作用。(a) TNBS指挥的结肠炎和工程酵母 (BY、J8、J16和J17) 给药的实验有猜度打算。(b) 各组小鼠结肠腔内丁酸含量。(c-e) 逐日体重，(d)逐日DAI评分和(e)小鼠经直肠灌肠后的结肠长度。(f) 各组小鼠的结肠组织图像。(g) H&E染色。(h) 每组小鼠的结肠挫伤评分。
图源：参考文件 [1]
综上，该盘考期骗合成生物学轨范已毕了酿酒酵母菌株丁酸的合成，并通过颐养工程酵母的丁酸产量，以达到体表里颐养IBD的最好收尾。盘验阐发了补充丁酸对IBD的颐养作用，通过规复丁酸水平规复肠谈菌群稳态，有望为IBD的精确颐养提供新的参考。
致谢
中南大学湘雅三病院 王念念丹 傅甜
浙江大学医学院 孙誉郝
浙江大学 陈杰
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